ウルソデオキシコール酸は血液脳関門を通過できた！

ウルソデオキシコール酸（UDCA）とタウリンで遅発性ジスキネジアを止めることができてます

そこで素朴な疑問が、、

ウルソデオキシコール酸およびその主たる複合体であるグリコウルソデオキシコール酸は、神経保護作用を有する胆汁酸である。我々の以前の研究は、重度の黄疸の場合のように、高レベルの非抱合型ビリルビン（ＵＣＢ）に曝露された神経細胞におけるそれらの抗アポトーシス性、抗炎症性、および抗酸化特性を実証した。ヒト脳微小血管内皮細胞の細胞株のコンフルエントな単層によって形成された血液脳関門の単純化されたモデルにおいて、ＵＣＢはカスパーゼ−３活性化および細胞死、ならびにインターロイキン−６放出および喪失を誘導することが示されている。血液脳関門の完全性ここでは、重度の新生児高ビリルビン血症を模倣し、同じ実験的血液脳関門モデルを使用して、in vitro条件でのUCBによる血液脳関門特性の破壊に関して、これらの胆汁酸の予防および修復効果を試験した。両方の胆汁酸はUCBによって誘発されるアポトーシス細胞死を減少させたが、グリコウルソデオキシコール酸のみがカスパーゼ-3活性化を有意に打ち消した。ウルソデオキシコール酸のみがサイトカイン放出を無効にしたのに対し、胆汁酸もインターロイキン-6 mRNAの上方制御を妨げた。バリアの完全性に関しては、ウルソデオキシコール酸のみがUCB誘発バリア透過性を無効にした。より良い保護効果が胆汁酸前処理によって得られたが、強い効力はUCB処理後のそれらの添加によって依然として観察された。最後に、両方の胆汁酸は時間依存的にヒト脳微小血管内皮細胞のコンフルエントな単層を横断する能力を示した。まとめると、データは、ＵＣＢ誘発血液脳関門破壊およびヒト脳微小血管内皮細胞に対する損傷に対するウルソデオキシコール酸およびグリコウルソデオキシコール酸の予防的および修復的効果についての治療時間枠を開示する。

新生児期において、非抱合型ビリルビン（UCB）へのレベルの上昇と長期暴露はビリルビン誘発性神経機能障害の引き金となるかもしれない（Cohen et al。、2010）。神経学的機能不全の根底にある機序はまだはっきりしていないが、UCB誘発性神経毒性の理解は過去数年間で非常に高まってきた（Brites and Brito、2012）。神経細胞の酸化ストレス、グリア細胞による炎症誘発性サイトカインの放出、およびミエリン形成の変化を伴う、膜構造、性質、および機能の一般的な障害（Rodriguesら、2002b; Britoら、2004）が実証されている（Silva）。ら、２００２年、２０１０年； Ｆａｌｃａｎｏら、２００６年； Ｆｅｒｎａｎｄｅｓら、２００６年； Ｂｒｉｔｏら、２００８年； Ｖａｚ​​ら、２０１０年； Ｂａｒａｔｅｉｏら、２０１４年）。血液脳関門（ＢＢＢ）、特にビリルビン誘発性神経機能障害の過程における脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）の重要な役割の認識もまた高まっている。実際、ブタおよびラットのBMECに対するUCBの影響（Akinら、2002年; Cardosoら、2012年）およびマウスBMEC系（Kapitulnikら、2012年）におけるUCBの誘導は内皮細胞の喪失を誘導することを明らかにした。実行可能性ヒトＢＭＥＣ（ＨＢＭＥＣ）に関する我々の最近の研究は、ＵＣＢが内皮細胞の生存を減少させ、病的状態におけるＢＢＢ破壊に関与することが知られているインターロイキン−６のようなサイトカインの放出を誘導することを示した（Ｐａｌｍｅｌａら、２０１１）。 （Kaur and Ling、2008; Carvey et al。、2009）。さらに、UCBへのHBMEC曝露は、相互作用の時間に応じて二相性の効果をもたらし、長期のインキュベーションは内皮接合部を損ない、バリアの完全性を著しく損なった（Palmela et al。、2012）。興味深いことに、アストロサイトの存在下でもBMECのバリア特性のUCB誘発破壊が観察された（Cardoso et al。、2012）、これはin vivo条件によりよく似たin vitro共培養モデルである。重要なことに、これらのインビトロ証拠は、脳実質における血管新生の増加および赤血球およびアルブミンの浸潤を示す、黄疸早産児の剖検研究において確認されている（Brito et al。、2013）。さらに、最近のKernicterus症例の研究では、小脳、海馬、大脳基底核などのUCB毒性に対する最も感受性の高い脳領域が、周皮細胞の血管被覆および基底膜の変化としてBBB機能障害の顕著な兆候を示している。パルメラら、提出）。したがって、これらの特徴は、少なくともビリルビン脳症を伴う重症の早産児において、血管壁の透過性が向上していることを示している。

ヒトの循環中に非常に低レベルで存在する胆汁酸ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）は、胆汁うっ滞を伴う慢性肝疾患の治療として広く使用されている（Ｐｏｕｐｏｎら、１９９４年； Ｂｒｉｔｅｓら、１９９８年； Ｌａｚａｒｉｄｉｓら、１９９４年）。 、２００１）。 ＵＤＣＡは、肝臓起源のタウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）およびグリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）にコンジュゲートされており、これは治療中の患者において産生される胆汁酸コンジュゲートの約８０％を占める（Rudolph et al。、2002）。さらに、TUDCAのそれと比較してGUDCAの4倍の増加が、UDCAで治療された完全な肝外胆道閉塞を有する患者の胆汁において見出された（Rudolph et al。、2002）。いくつかの研究は、この胆汁酸の抗アポトーシス特性のために、アポトーシスレベルの増加を伴う非肝臓疾患の治療におけるUDCAの潜在的な役割を示唆している（Amaral）。ら、２００９ｂ）。興味深いことに、UDCAの抗アポトーシス特性は最近ビリルビンにさらされた骨芽細胞で示されました（Ruiz-Gaspa et al。、2014）。我々自身の研究は、ＵＤＣＡおよびＧＵＤＣＡがアストロサイトをアポトーシスから保護しそして炎症誘発性サイトカインの産生を抑制することを示した（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、２０００年； Ｓｉｌｖａら、２００１ｂ； Ｆｅｒｎａｎｄｅｓら、２００７ａ）。神経細胞死とシナプスの変化（Silva et al。、2012）。さらに、GUDCAは、ニューロンの酸化還元状態、ミトコンドリア機能障害およびエネルギー障害におけるUCB誘発性の変化を無効にした（Britoら、2008年; Vazら、2010年）。興味深いことに、ＵＤＣＡおよびそのコンジュゲートの作用機序は、細胞膜構造の安定化およびその動的特性の維持に依存しているように見え、それらは、膜脂質の極性および流動性ならびにタンパク質秩序の変化を妨げる能力から導かれる。および酸化還元状態（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、２００１、２００２ｂ； Ｓｏｌａら、２００２）。

ヒトの循環中に非常に低レベルで存在する胆汁酸ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）は、胆汁うっ滞を伴う慢性肝疾患の治療として広く使用されている（Ｐｏｕｐｏｎら、１９９４年； Ｂｒｉｔｅｓら、１９９８年； Ｌａｚａｒｉｄｉｓら、１９９４年）。 、２００１）。 ＵＤＣＡは、肝臓起源のタウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）およびグリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）にコンジュゲートされており、これは治療中の患者において産生される胆汁酸コンジュゲートの約８０％を占める（Rudolph et al。、2002）。さらに、TUDCAのそれと比較してGUDCAの4倍の増加が、UDCAで治療された完全な肝外胆道閉塞を有する患者の胆汁において見出された（Rudolph et al。、2002）。いくつかの研究は、この胆汁酸の抗アポトーシス特性のために、アポトーシスレベルの増加を伴う非肝臓疾患の治療におけるUDCAの潜在的な役割を示唆している（Amaral）。ら、２００９ｂ）。興味深いことに、UDCAの抗アポトーシス特性は最近ビリルビンにさらされた骨芽細胞で示されました（Ruiz-Gaspa et al。、2014）。我々自身の研究は、ＵＤＣＡおよびＧＵＤＣＡがアストロサイトをアポトーシスから保護しそして炎症誘発性サイトカインの産生を抑制することを示した（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、２０００年； Ｓｉｌｖａら、２００１ｂ； Ｆｅｒｎａｎｄｅｓら、２００７ａ）。神経細胞死とシナプスの変化（Silva et al。、2012）。さらに、GUDCAは、ニューロンの酸化還元状態、ミトコンドリア機能障害およびエネルギー障害におけるUCB誘発性の変化を無効にした（Britoら、2008年; Vazら、2010年）。興味深いことに、ＵＤＣＡおよびそのコンジュゲートの作用機序は、細胞膜構造の安定化およびその動的特性の維持に依存しているように見え、それらは、膜脂質の極性および流動性ならびにタンパク質秩序の変化を妨げる能力から導かれる。および酸化還元状態（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、２００１、２００２ｂ； Ｓｏｌａら、２００２）。

内皮細胞に対するこれらの胆汁酸の有益な効果に関しては、ほとんど知られていない。それにもかかわらず、TUDCAはアミロイド-β誘導アポトーシス（Viana et al。、2009）および白血球ローリングおよび脂質過酸化生成物によって誘導された内皮への接着（Vladykovskaya et al。、2012）に対しても防御できることが示された。船舶修理の促進に関して（Cho et al。、2015）。興味深いことに、UDCAはエンドセリン-1産生を阻害し（Ma et al。、2004）、抗血管新生能を有することが示され（Suh et al。、1997; Woo et al。、2010）、内皮細胞への影響が示唆された。はるかに複雑な方法です。しかしながら、ＵＤＣＡおよびＧＵＤＣＡの保護効果がヒトＢＢＢの内皮細胞に、特にＵＣＢ誘発損傷に向けて発揮されるかどうかは依然として不明である。したがって、我々はここでそのような胆汁酸がUCB誘発アポトーシスおよび超微細構造変化からHBMECを保護することができるかどうかを最初に評価することを目的とした。次に、本発明者らは、ＵＤＣＡおよびＧＵＤＣＡが内皮透過性のメディエーター、インターロイキン−６、ならびにＵＣＢによって誘導されるバリアの完全性の変化の生成を防止することができるかどうかを調査することを意図した。 UCB曝露の前、または孵卵開始後4および8時間に細胞をUDCAおよびGUDCAで処理することにより、ビリルビン誘発性神経機能障害が必要とされる黄疸の乳児に使用する機会の治療ウィンドウを確立することを目的とした。従来の治療法を補完する薬。

基礎培地Roswell Park Memorial Institute 1640、抗生物質 – 抗真菌剤溶液、ヒト血清アルブミン（画分V、脂肪酸不含）、ウシ血清アルブミン、Hoechst 33258染料、フルオレセインナトリウムおよびUCBは、Sigma Chemical Co.（St. louis、）から購入した。米国ミズーリ州）。非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、ウシ胎児血清および最小必須培地ビタミンは、Biochrom AG（Berlin、Germany）から入手した。 Nuserum IVおよびラットテールコラーゲンIは、BD Biosciences（Erembodegem、ベルギー）から入手した。 TRIzol Plus RNA精製キットは、Invitrogen（Carlsbad、CA、USA）から入手した。カスパーゼ-3基質およびAc-Asp-Glu-Val-Asp-p-ニトロアニリドは、Calbiochem（San Diego、CA、USA）から入手した。 DuoSet ELISAキットは、R＆D Systems（Minneapolis、MN、USA）から入手した。リアルタイムPCR分析用のプライマーは、Thermo Scientific（Soeborg、Denmark）から購入した。 RevertAid Hマイナス一本鎖cDNA合成およびMaxima SYBR Green qPCR Master Mix（2×）は、Fermentas（Burlington、ON、Canada）から入手した。他の全ての化学物質は分析用グレードのものであり、Merck（Darmstadt、Germany）から購入した。

内皮細胞に対するＵＣＢ誘発損傷がＵＤＣＡおよびＧＵＤＣＡの存在下で無効にされ得るかどうかを試験するために、我々はヒトＢＢＢの単純化モデルとしてＨＢＭＥＣ株を使用した。この細胞株は、ＳＶ４０ラージＴ抗原でトランスフェクトされたＨＢＭＥＣの初代培養物に由来し（Ｓｔｉｎｓら、２００１）、最近、バリア性に関してインビトロＢＢＢに最も適したヒト細胞株であることが証明された（Ｅｉｇｅｎｍａｎｎら、１９９５）。 2013）。細胞を、１０％ウシ胎児血清、１０％ＮｕＳｅｒｕｍ ＩＶ、１％非必須アミノ酸、１％最小必須培地ビタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ ｌ－グルタミン、および１ｍＭを補ったＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地で培養した。前述のように、コラーゲンＩ被覆カバーガラスまたはプレートに８×１０ ４細胞／ ｍＬの密度で播種し、培養２日後に処理した（Ｐａｌｍｅｌａら、２０１１）。完全性研究のために、フルオレセインナトリウムに対する傍細胞透過性の測定に基づいて、細胞をコラーゲンＩ被覆ポリエステルトランスウェルインサート（０．４μｍ、Corning Costar Corp.、USA）上に８×１０ ４セル／インサートの密度で播種し、その後処理した。培養8日間（Palmela et al。、2012）。内皮培養物を、５％ＣＯ ２に富む湿潤雰囲気中で３７℃に維持し、そして全ての実験をコンフルエントで実施した。

UCBを精製し（Mcdonagh and Assisi、1972）、10 mMストック溶液を0.1 M NaOH中で調製し、調製直後に使用した。等量の０．１Ｍ ＨＣｌを添加することによってｐＨ値を７．４に回復させ、そして光分解を回避するために全ての手順を遮光下で実施した。 ＨＢＭＥＣ系の集密的単層を１００μＭのヒト血清アルブミンの存在下で１００μＭのＵＣＢと共に、または添加せずに（対照）インキュベートした。この実験条件は、我々が報告した黄疸の症例で見られたビリルビン/アルブミン比（1：1のモル比; 8.7 mg / g）を模倣し、最近関連した5.4〜21.0 mg / gの比の範囲内である。エジプトでは急性ビリルビン脳症に罹患している（Iskander et al。、2014）。広く使用されているペルオキシダーゼ法による非結合ビリルビン、または遊離ビリルビンの決定（Rocaら、2006）は、Palmelaらによって以前に報告されたように、この実験条件が23.6nMの遊離ビリルビン濃度に対応することを示した。 （2012）。本インビトロモデルにおいて使用される遊離ビリルビンレベルは、中等度黄疸新生児群（１９．１±１．５ｎＭ）において我々によって見出された値の範囲内であり、そしてＡｈｌｆｏｒｓ ｅｔ ａｌ。 （2009）（21–51 nM）乳児で黄疸のために再入院した。また、我々の研究室で得られた遊離ビリルビン値とRocaらによって示されたものとの間の明らかな食い違いがあることを言及すること。 （2006）Roca等による事実に起因するかもしれません。 （2006）それらのシステムに細胞を含みませんでした、従って細胞に結合/含まれるビリルビンの割合（Britoら、2000年; Palmelaら、2012年）もUCB異化作用のための非共役経路も考慮しませんでした（Ahlfors et al。、2009）。各パラメーターに使用される潜伏期間は、以前の研究で観察された最大の効果を得るための時間に基づいて、1〜48時間の間で変動した（Palmela et al。、2011、2012）。インキュベーション培地は、インキュベーション培地中のアルブミンの最終濃度の乱れを避けるために、ウシ胎児血清およびNuserum IVを含まない通常の培地中にあった。

胆汁酸ＵＤＣＡおよびＧＵＤＣＡ、非抱合型については１０００、グリシンアミド化分子については１０５のオクタノール／水分配係数を有する分子、ならびに前者および後者については３．０および２．０２のｌｏｇＰ値を用いて同時インキュベーション研究も行った。 （Roda et al。、1990）。同時インキュベーション試験において、ＵＤＣＡまたはＧＵＤＣＡを５０μＭの最終濃度で添加した。これは、ＵＤＣＡによる治療を受けている患者の循環中に見出される。特に、５０μＭのＧＵＤＣＡの濃度は、１日当たり体重１キログラムあたり１３〜１５ｍｇの用量でＵＤＣＡで治療した後の患者の血清中に一般的に見られる（Ｐｏｄｄａら、１９９０； Ｐｏｕｐｏｎら、１９９４ ； Ｂｒｉｔｅｓら、１９９８）。我々は以前、そのような濃度がニューロンに対して毒性ではないことを示し（Silva et al。、2001b）、そして最も重要なことに、神経変性の予防において有益な特性を有する（Brito et al。、2008; Vaz et al。、2010）。胆汁酸を３つの異なる時点で添加した：ＵＣＢ添加の１時間前およびＵＣＢインキュベーションの４または８時間後。短期間のＵＣＢインキュベーションについては、胆汁酸との１時間のプレインキュベーションの効果のみを評価した。これらの分子の毒性がないことを確認するために、ＵＤＣＡおよびＧＵＤＣＡ（ＵＣＢなし）で処理した細胞を含む適切な対照も含めた。

完全性実験のために、内皮細胞を培養プレートウェルに挿入された半透性フィルター上で培養した。このシステムでは、2つのコンパートメントがあります：UCB、胆汁酸およびヒト血清アルブミンが添加された「血液側」と見なすことができる頂端または上部コンパートメント、および脳側」

カスパーゼ-3活性およびアポトーシス核の数は、これらの時点がUCB単独の最大効果を表すので、それぞれ4および48時間のUCB曝露後に決定された（Palmela et al。、2011）。

我々の研究室で通常行われているように（Palmela et al。、2011）、カスパーゼ-3の活性を比色法（Calbiochem、Darmstadt、Germany）により測定した。結果は、対照値からの倍数変化として表した。ヘキスト３３２５８染色後のＨＢＭＥＣ系統の核形態の評価は、以前に記載されたように評価した（Ｐａｌｍｅｌａら、２０１１）。 ＡｘｉｏＳｃｏｐｅ．Ａ１顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ、ゲッティンゲン）に適合させたＬｅｉｃａ ＤＦＣ ４９０カメラ（Ｌｅｉｃａ、ドイツ、ウェッツラー）を用いて蛍光を可視化した。値はアポトーシス核の百分率として表した。

ＵＤＣＡまたはＧＵＤＣＡで前処理したＨＢＭＥＣ中でＵＣＢに４８時間暴露した後、透過型電子顕微鏡法によって超微細構造分析を行った。細胞を、０．１Ｍリン酸緩衝液中の１．２％グルタルアルデヒドおよび同じ緩衝液中の１％四酸化オスミウムで固定し、段階的な一連のエタノールで脱水し、次いでエポキシ樹脂中に包埋した。超薄切片を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、80kVの加速電圧でHitachi H-7500透過型電子顕微鏡（東京、日本）で観察した。

インターロイキン-6の発現および分泌におけるUCB単独の最大の効果がこれらの時点で観察されたので、HBMEC系をmRNA分析のために1時間、およびサイトカイン放出定量のために4時間UCBに曝露した（Palmela et al。、2011）。 ）

ｍＲＮＡ発現の分析は、以前に記載されているように（Ｐａｌｍｅｌａら、２０１１）、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２×）を用いた定量的リアルタイムＰＣＲによって行った。このアッセイは、インターロイキン-6 mRNAの発現レベルを標準化するための内因性対照としてβ-アクチンを使用して実施した。以下の配列をプライマーとして使用した：インターロイキン−６センス、５’− ＧＡＣＡＧＣＣＡＣＴＣＡＣＣＴＣＴＴＣＡ − ３ ‘およびアンチセンス、５’− ＴＴＣＡＣＣＡＧＧＣＡＡＧＴＣＴＣＣＴＣ − ３’（Ｗａｎｇら、２００６）。 β-アクチンセンス、5’-ACAGAGCCTCGCCTTTGCCG-3 ‘およびアンチセンス、5’-TGGGCCTCGTCGCCCACATA-3’（NM_001101.3）。 PCRの非特異的産物はいずれの場合にも見出されなかった。個々の遺伝子の効率を考慮に入れて、ΔΔＣＴ式のＰｆａｆｆｌ修正（ＣＴ、蛍光が検出の閾値レベルを超えるサイクル数）を使用して相対定量化を行った。結果をβ－アクチンに対して正規化し、各サンプルの鋳型の初期量を対照サンプルからの倍率変化として決定した（参照）。

内皮インターロイキン-6放出は、製造元の説明書に従って、特定のDuoSet ELISA開発キットを用いて二重に評価した。マイクロプレートリーダーを使用して、６２０ｎｍの参照フィルターを用いて４５０ｎｍの波長で測定値を得た。平均対照値は１３５ｐｇ ／ ｍＬであり、結果は対照からの変化倍数として表した。

透過性を調節するＵＤＣＡおよびＧＵＤＣＡの能力は、４８時間ＵＣＢで処理した細胞において評価され、その時点は、ＵＣＢによるＨＢＭＥＣ単層の完全性状態の最大の崩壊をもたらす（Ｐａｌｍｅｌａら、２０１２）。

我々の以前の研究では、UCBがフルオレセインナトリウム（Palmela et al。、2012）、低分子量トレーサー（376 Da）に対する透過性を増加させるが、アルブミン結合Evans blue（高分子量トレーサー）に対しては増加させないことを見出した（68）。 kDa）したがって、この研究では、HBMEC傍細胞透過性アッセイを、以前に記載されているように（Veszelkaら、2007年； Cardosoら、2012年； Palmelaら、2012年）、フルオレセインナトリウムを用いて行った。簡単に説明すると、細胞培養インサートを、基底部にRinger – Hepes溶液（118 mM NaCl、4.8 mM KCl、2.5 mM CaCl 2、1.2 mM MgSO 4、5.5 mM d-グルコース、20 mM Hepes、pH 7.4）を含む12ウェルプレートに移した。コンパートメント。フルオレセインナトリウム溶液（リンゲル – ヘペス中の10 mg / mLフルオレセインナトリウム）を上部チャンバーに加えた。 20、40、および60分後にインサートを新しいウェルに移した。下部チャンバー溶液を収集してナトリウムフルオレセインレベルを決定した（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｆ － ２０００蛍光分光光度計、励起：４４０ｎｍおよび発光：５２５ｎｍ）。無細胞インサートを横切る流束もまた測定した。内皮透過係数は、以前に記載されたように計算され（Ｄｅｌｉら、２００５）、平均対照透過係数は１．４×１０ －５ ｃｍ ／ ｓであった。

ＵＤＣＡおよびＧＵＤＣＡがＢＢＢ内皮を通過することができるかどうかを立証するために、二室培養システムを使用した。胆汁酸を上部チャンバーに添加し、そして下部チャンバーからの培地を４および４８時間のインキュベーション後に集めた。 ＨＢＭＥＣ単層を横切る胆汁酸通過は、酵素 – 蛍光定量アッセイによってＵＤＣＡおよびＧＵＤＣＡの濃度を測定することによって評価された（Ｂｒｉｔｅｓら、１９９８）。結果は平均濃度（μＭ）±ＳＥＭとして示した。

結果は、少なくとも３回の別々の実験からの平均値±ＳＥＭ値として表される。群間の差は、Ｐｒｉｓｍ ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を用いた一元配置分散分析によって決定した。 P値が0.05未満の場合、統計的有意性が考慮されました。

UDCAとGUDCAはUCB誘導アポトーシスからHBMECを保護するが、カスパーゼ3活性化の減少にはGUDCAだけが有効である

ＨＢＭＥＣ系におけるＵＣＢ誘導アポトーシスは、曝露時間と共に増加しそして４８時間で最大レベルに達したアポトーシスの特徴の存在を含む（Ｐａｌｍｅｌａら、２０１１）。したがって、今回は、UDCAおよびGUDCAがHBMECをUCB誘導アポトーシスから保護する能力を評価するために選択された。胆汁酸を３つの異なる時点で添加し、損傷の前後に添加した場合のそれらの可能性を評価した。 UDCAとGUDCAの添加により、添加時期にかかわらずUCB損傷が減少しました（図（図1）.1）。この保護効果は、特にＵＣＢ添加の１時間前に添加した場合に、ＧＵＤＣＡによる処置において最大であった（ＵＣＢ値からの５４％の減少、Ｐ ＜０．００１、同じ時点でのＵＤＣＡについての４２％、Ｐ ＜０．０１）。重要なことに、UCB添加の8時間後に添加した場合、胆汁酸は部分的にUCB損傷と比較して約30％の防御率減少でUCB損傷を回復させた（図（図1）、1）。

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