「2019年07月」一覧

遅発性ジスキネジアと口腔異常感克服！

遅発性ジスキネジア, ウルソデオキシコール酸 

遅発性ジスキネジア対策の服用状況（7月4日現在）はこちら
※ミトコンドリア機能低下との関連性についても

7月12日加筆しました

ご報告です！

６月中旬からウルソデオキシコール酸（熊の胆汁酸TUDCAの主成分を合成した物質）とタウリンの同時摂取でジスキネジアの症状（口もぐもぐ）と口腔異常感を止めることに成功しました！

四六時中、口に意識が集中してしまい、何をやっていても集中力に欠け中途半端。
それが今はやっと口を気にすることなく生活ができるようになりました。

ユビキノール（還元型コエンザイムQ１０）の大量摂取でもジスキネジア（口をもぐもぐ）は止めることができていましたが、
ユビキノールの大量摂取よりUDCAの方が、口腔内の異常感にもよく効いてます。
よりスッキリはっきり止まります！

このまま飲み続ければやがて根治か？と思うほどの予感もあります！

 

そこで、私の他にもSNSで知り合ったジスキネジアをもつ男性にもウルソ（UDCAの略）やタウリンを試してもらったところ（６月23日頃から開始）

【A氏の場合】

その方（仮にA氏）はウルソを150mg飲んですぐ「食いしばり（ジスキネジアの症状の一種）」がなくなったそうです。

そして7月11日、ウルソを300mgに増量してみたところ、食いしばり、口もぐもぐ両方の症状が止まったと連絡ありました。
A氏は他に薬剤性パーキソニズムと思われる手の震えという症状もあるのですが、手の震えに関しても「ちょっと楽になった」と言ってました。

ウルソデオキシコール酸でジスキネジアの症状を止めることができたのは、私とA氏で２例目です。

ちなみにA氏は現在「ウルソ」「タウリン」「ユビキノール」の服用です。

 

私は今まで様々な文献を読み漁ってきましたが、今回数々の点と点が線となりました。

ウルソとタウリンは遅発性ジスキネジアにダイレクトに効く組み合わせということを確認できました。

当初はウルソ単剤で試し症状は止まりましたが、タウリンを同時摂取することでより効果が高いことも実感。

ジスキネジアとともに長年口腔に違和感も感じておりましたがそれもスッキリ！
ちなみに私の口腔異常感は主に「唇や舌の痺れるような感覚」「神経のない歯の痛み」「歯や歯茎が浮いているようなむずむずした感覚」「舌で歯の裏側を無意識にこする」
これもウルソとタウリンでスッキリしてます！

現在もサプリは沢山飲んでいますが、ジスキネジアは体の栄養状態の底上げがあればウルソとタウリンだけでも止まると思います。
出来ればセットとして私がお勧めしているミトコンドリアサポートセットも追加で飲んでいただきたいです。

///////////ジスキネジア対策

ウルソデオキシコール酸（インド製）　１錠300mg
タナベ胃腸薬ウルソ　１錠50mg
タウリン

飲み方
ウルソとタウリンを一緒にぬるま湯とともに服用


【私の場合】
最初の１週間のUDCA量
1回300mgを1日3回～4回

7月6日までUDCA量
1回150mg1日3回～4回

7月7日からタナベ胃腸薬ウルソ
1回50mg～150mgに適時調整してみたが効いている
///////////ミトコンドリアサポートセット

ユビキノール（還元型コエンザイムQ10）
アセチル・L-カルニチン＆アルファリポ酸
ビタミンC
ビタミンE（処方薬名ユベラN）
ビタミンB群（処方薬名ビタノイリン）

それでは数々の点を紹介

１）タウリンとミトコンドリア病とTUDCA
タウリンとミトコンドリア病について以前まるのブログでも書きました
http://bzd-phytotoxicity.org/?p=239

上記ブログ内で紹介している熊本大学の研究にTUDCAの記述があります
https://www.jst.go.jp/pr/announce/20180110/index.html
抜粋
MELASやMERRFなどタウリンの機能低下によるミトコンドリア病に対する治療薬の開発につながります。細胞やモデル動物で有効性が示されたTUDCAは、イタリアなどヨーロッパで肝疾患の治療薬として使用されており、医薬品としての安全性が確かめられています。今後は、TUDCAがMELASやMERRFなどのミトコンドリア病の治療薬となるかを調べるための臨床研究を実施することを計画しています。

また、MELASやMERRF以外のミトコンドリア病やさまざまな疾患においても、タウリンの働きが二次的に低下するという同様な分子機構で発症する可能性が考えられます。今後は、ミトコンドリア機能低下を示すさまざまな疾患についてもタウリンの働きを調べ、TUDCAの効果を検討していきたいと考えています。

２）動物胆系生薬「牛黄（ゴオウ）」
処方せん薬局にてサンプルとしていただいたドリンク剤「若甦（牛黄入）」でジスキネジア が止まる経験をする
しばらく続けましたが、１本600円もすることから継続を断念
牛黄は牛の胆石です
牛黄と熊胆（TUDCA）、、ともに胆汁酸が鍵か？
と思い始めたキッカケ

３）ウルソデオキシコール酸がパーキンソン病やレビー小体型認知症に効く可能性

http://kunota506.com/2015/08/19/post-4532/

肝臓の薬がパーキンソン病の進行を遅らせる可能性を示す結果が報告された。

研究者らは、肝臓病治療薬であるウルソデオキシコール酸（UDCA）がパーキンソン病に関連するLRRK2遺伝子変異に働く可能性を見出した。

研究者らはUDCAが症状の有無に関わらず、LRRK2変異を持つドーパミン神経細胞のミトコンドリア機能を改善することを示した。

さらに、LRRK2変異を持つショウジョウバエにUDCAを飲ませると、神経細胞の変性による視機能の低下が遅れることを明らかにした。

ミトコンドリア機能の低下は、LRRK2変異を持たないパーキンソン病患者の細胞でも認められるため、研究者らはUDCAが他のタイプのパーキンソン病やその他の神経変性疾患にも効果があることを期待している。

RRK2は脳全体に分布しており、レビー小体型認知症との関連も示唆されています。ウルソデオキシコール酸は「ウルソ®」として古くから肝機能障害に広く使われている安価な薬です。製薬会社が乗り気になるかどうかわかりませんが、臨床試験の結果が待ち遠しいです。

ここまで書いて気がついたのですが、2013年にもウルソデオキシコール酸がミトコンドリア機能の改善を介してパーキンソン病に効果があるのでは？という以下の記事がありました。やはり、儲かる可能性がないと臨床試験はされないか？

パーキンソン病の有望な薬、ウルソデオキシコール酸の研究
https://blog.goo.ne.jp/news-t/e/d767e31c42120fa516d441dc31ab0e33

４）脳局在型胆汁酸トランスポーターSLC10A4の機能解析
https://t.co/49IBQ00jSX?amp=1
抜粋
胆汁酸の細胞毒性は疎水性が高いほど高く、親水性が高いほ ど低くなる傾向がある。
TCA はタウリン抱合型であるため親水性胆汁酸に分類されるが、さらに親水性の高いtauroursodeoxycholic acid (TUDCA)は神経保護作用を持つことが報告されている。
神経保護作用を持つ親水性胆汁酸として他にUDCAが挙げられる。
したがって、トロンビン処置によ り TUDCA や UDCA の輸送能が亢進するならば、神経保護の目的に効果を示す可能性が考えられる。
本研究において、TUDCA および UDCA の取り込み能は 評価しなかったが、今後これらの取り込み能について検討が必要と考える。

５）古くて新しい胆汁酸の研究（脳の胆汁酸に言及） という東北大教授のコラム
https://t.co/vBFjiJovwO?amp=1
抜粋
脳の中にも胆汁酸がある
胆汁酸は蛋白質溶解作用（これをデタージェント作用という）を持っており、神経の軸策を溶かしてしまうということもわかっています。このため、これまでは脳内には存在しないと考えられてきました。
しかし、私たちは従来とは異なる新しい測定法を作り検索したところ、ケノデオキシコール酸が結構多量に存在し、しかもある種の蛋白質（まだ構造は明らかになっていません）と、大変強固に結合した状態で存在することがわかりました。
さらに調べてみると、脳内で活性は弱いもののこの胆汁酸を生合成する酵素系が存在すること、また脳内のある特定の組織に胆汁酸に特異的なトランスポーターが存在していることもわかってきました。この組織はパーキンソン病発症と深く関わっていることから、今後、脳内における胆汁酸の役割を解明し、病気との関係、さらには適切な医薬品の創製に役立てるつもりです

６）ALSとタウロウルソデオキシコール酸
http://www.miguchi.net/archives/7147

当事者ブログから抜粋
筋萎縮性側索硬化症 (ALS) の新規治療薬 Tauroursodeoxycholic acid (タウロウルソデオキシコール酸, TUDCA) のパイロット研究の結果が、European Journal of Neurology誌に掲載されました (2015年2月9日 published online)。
ウルソデオキシコール酸 (商品名 ウルソ) は胆汁うっ滞、肝機能障害の治療で良く用いますが、タウロ・ウルソデオキシコール酸の名前は初めて聞きました。肝臓で産生される親水性の胆汁酸で、脂肪肝の治療に用いられる薬剤なのだそうです。
細胞保護や抗アポトーシス作用があるそうです。

National Center for Biotechnology Information（国立生物工学情報センター）
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25664595
リルゾールを内服中の 34名の ALS患者に、TCDUAないしは プラセボを上乗せした。3ヶ月後に評価し、一次アウトカムは ALSFRS-Rスコアのスロープの 15%以上改善、二次アウトカムは群間比較 (ALSFRS-Rスコア、ALSFRS-Rスコアの線形回帰スロープ、有害事象) とした。
両群間の有害事象に差はなく、効果があったのは、TUDCA 87%, プラセボ 43% (P=0.021) だった。
ベースラインを調整した試験終了時の ALSFRS-Rは、TUDCA群で有意に高かった (p=0.007)。
線形回帰スロープでは、TUDCA群の方が有意に進行が遅かった (P<0.01)。

７）アルハカさんからの問いかけ
アルツハッカー　alzhacker
http://alzhacker.com/

私は栄養療法を自分なりに実践してきました
当初はオーソモレキュラーや三石理論や藤川徳美先生を参考にしてましたが
一番参考にしているのはリコード法を日本でいち早く紹介したアルハカさんのブログです

アルハカさんから紹介された情報

ウルソデオキシコール酸は血液脳関門を通過できた！

ウルソデオキシコール酸
UCB（高レベルの非抱合型ビリルビン）によって誘発されるアポトーシス細胞死を減少させた
サイトカイン放出を無効にした
UCB誘発バリア透過性を無効にした

8）タウリンについて（7月5日加筆）

牡蠣小屋で牡蠣を20〜30個食べたことがあり、その時ジスキネジア症状が止まってビックリした経験（大量のタウリンで症状が止まったと思われました）

ジスキネジアはもしかするとミトコンドリアの機能低下で起こるのではないかと疑っていたこともあり、川崎医科大学が行っていた医師主導の治験を模倣することに

難病指定のミトコンドリア病MELAS（ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様発作症候群）へのタウリン大量摂取療法

内容は、タウリン１回４gを 1日3回（合計12g）の摂取でしたが、実際は１日15gくらいまで飲んでみました（現在は保険適用）

確かにジスキネジアは止まりましたが、ものすごく眠くなり生活に支障をきたすほど
結局断念し他の方法を探し始める

※ミトコンドリア脳筋症（ミトコンドリア病）について
https://medical.jiji.com/medical/011-0072-01

以上、取り急ぎご報告でした！

UDCAが孤発性や家族性アルツハイマーの線維芽細胞においてミトコンドリア機能を改善

アルツハイマー, ウルソデオキシコール酸

海外の情報

UDCA（ウルソデオキシコール酸）が孤発性や家族性アルツハイマーの線維芽細胞においてミトコンドリア機能を改善

 

現在海外では、UDCAがパーキンソン病、レビー小体型認知症、ALSや、他の神経変性疾患にも効果が期待されているようです
今回、孤発性アルツハイマー・家族性アルツハイマーにも効果があるという文献を偶然見つけました

私のジスキネジア まで止めてくれているウルソデオキシコール酸（UDCA）は、大脳基底核の神経変性疾患全般に応用できるのではないか、と期待してしまいます

 

UDCAは熊の胆汁酸（動物胆生薬:熊胆）の主成分を化学合成した薬ですので、肝疾患などには昔から処方されている非常に副作用の少ない薬です

１日の処方量は肝硬変などで600mg/day
最大処方量は900mg/dayとされています

私は飲み始め１週間は1200mg/dayを飲んでおりました

UDCA単体よりタウリンと併用することで効果が高くなることを体感し現在は

１回量　UDCA 150mg +タウリン1000mg
を１日４～５回ぬるま湯で服用
※7月7日からタナベ胃腸薬ウルソ１回50mgに変更

日によっては１日３回で済むこともあります
食前・食後関係なく、いつ飲んでも15～２０分位で症状が止まります

参考
肝疾患の治療、肝機能や消化不良の改善：通常、成人は主成分として1回50mgを1日3回服用
胆石の溶解：通常、成人は1回2錠（主成分として200mg）を1日3回服用
原発性胆汁性肝硬変およびC型慢性肝疾患における肝機能の改善：通常、成人は1回2錠（主成分として200mg）を1日3回服用
治療を受ける疾患や年齢・症状により適宜増減されますが、増量する場合の1日最大服用量は9錠（900mg）

※原発性胆汁性肝硬変（PSC）に対しての高容量服用については副作用報告がありました

 

 

 

National Center for Biotechnology Information（国立生物工学情報センター）
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6193139/

以下はUDCAとアルツハイマーについての文献の機械翻訳

抜粋

ウルソデオキシコール酸は散発性または家族性アルツハイマー病患者の線維芽細胞においてミトコンドリア機能を改善しDrp1を再分布する

アルツハイマー病（ＡＤ）は、世界中の認知症の主な原因である。ミトコンドリア異常はADの多くの細胞型で確認されており、古典的な病理学的凝集体の発達に先行する欠損がある。原発性胆汁性肝硬変症の治療薬であるウルソデオキシコール酸（UDCA）は、パーキンソン病患者、ならびにADおよびパーキンソン病のいくつかの動物モデルに由来する線維芽細胞のミトコンドリア機能を改善します。本稿では、散発性と家族性の両方のAD患者からの線維芽細胞におけるミトコンドリア機能と形態の両方を調べた。散発性AD（sAD）とPSEN1線維芽細胞の両方がミトコンドリアの膜電位とミトコンドリアの形態の変化の同じ障害を共有することを示します。しかしながら、ミトコンドリア呼吸は、sAD線維芽細胞において減少し、そしてPSEN1線維芽細胞において増加した。 AD線維芽細胞に見られる形態学的変化には、ミトコンドリア数の減少および細胞核周囲のミトコンドリアクラスター形成の増加、ならびに長いミトコンドリアの数の増加が含まれる。我々は、UDCAによる治療がミトコンドリアの膜電位と呼吸を増加させると同時にAD線維芽細胞における長いミトコンドリアの量を減少させることをAD患者組織で初めてここに示した。さらに、ダイナミン関連タンパク質1（Drp1）レベル、特にsADと家族性患者線維芽細胞の両方でミトコンドリアに局在する量の減少を示しています。 Drp1タンパク質量と局在はUDCA治療後に増加した。 Drp1をノックダウンすると、UDCAの回復効果はなくなります。本稿では、神経変性疾患の治療薬としてのUDCAの潜在的な使用法について説明します。

 

ウルソデオキシコール酸は血液脳関門を通過できた！

遅発性ジスキネジア, ウルソデオキシコール酸

ウルソデオキシコール酸（UDCA）とタウリンで遅発性ジスキネジアを止めることができてます
そこで素朴な疑問が、、
タウリンは血液脳関門（BBB）を通過できるけど、UDCAは？
アルハカさんにその疑問をつぶやいたところこのような返答をいただきました
udcaのBBB通過メカニズムはまだ解明されていないみたいですが、輸送体が存在し、通過はするようです。あとBBBの修復作用もあるみたいです。
UDCAって凄いぞ！
Google先生の機械翻訳をそのままコピペします
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親水性胆汁酸は非抱合型ビリルビンによる破壊からヒト血液脳関門内皮細胞を保護する：in vitro研究
ウルソデオキシコール酸およびその主たる複合体であるグリコウルソデオキシコール酸は、神経保護作用を有する胆汁酸である。我々の以前の研究は、重度の黄疸の場合のように、高レベルの非抱合型ビリルビン（ＵＣＢ）に曝露された神経細胞におけるそれらの抗アポトーシス性、抗炎症性、および抗酸化特性を実証した。ヒト脳微小血管内皮細胞の細胞株のコンフルエントな単層によって形成された血液脳関門の単純化されたモデルにおいて、ＵＣＢはカスパーゼ−３活性化および細胞死、ならびにインターロイキン−６放出および喪失を誘導することが示されている。血液脳関門の完全性ここでは、重度の新生児高ビリルビン血症を模倣し、同じ実験的血液脳関門モデルを使用して、in vitro条件でのUCBによる血液脳関門特性の破壊に関して、これらの胆汁酸の予防および修復効果を試験した。両方の胆汁酸はUCBによって誘発されるアポトーシス細胞死を減少させたが、グリコウルソデオキシコール酸のみがカスパーゼ-3活性化を有意に打ち消した。ウルソデオキシコール酸のみがサイトカイン放出を無効にしたのに対し、胆汁酸もインターロイキン-6 mRNAの上方制御を妨げた。バリアの完全性に関しては、ウルソデオキシコール酸のみがUCB誘発バリア透過性を無効にした。より良い保護効果が胆汁酸前処理によって得られたが、強い効力はUCB処理後のそれらの添加によって依然として観察された。最後に、両方の胆汁酸は時間依存的にヒト脳微小血管内皮細胞のコンフルエントな単層を横断する能力を示した。まとめると、データは、ＵＣＢ誘発血液脳関門破壊およびヒト脳微小血管内皮細胞に対する損傷に対するウルソデオキシコール酸およびグリコウルソデオキシコール酸の予防的および修復的効果についての治療時間枠を開示する。
前書き
新生児期において、非抱合型ビリルビン（UCB）へのレベルの上昇と長期暴露はビリルビン誘発性神経機能障害の引き金となるかもしれない（Cohen et al。、2010）。神経学的機能不全の根底にある機序はまだはっきりしていないが、UCB誘発性神経毒性の理解は過去数年間で非常に高まってきた（Brites and Brito、2012）。神経細胞の酸化ストレス、グリア細胞による炎症誘発性サイトカインの放出、およびミエリン形成の変化を伴う、膜構造、性質、および機能の一般的な障害（Rodriguesら、2002b; Britoら、2004）が実証されている（Silva）。ら、２００２年、２０１０年； Ｆａｌｃａｎｏら、２００６年； Ｆｅｒｎａｎｄｅｓら、２００６年； Ｂｒｉｔｏら、２００８年； Ｖａｚ​​ら、２０１０年； Ｂａｒａｔｅｉｏら、２０１４年）。血液脳関門（ＢＢＢ）、特にビリルビン誘発性神経機能障害の過程における脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）の重要な役割の認識もまた高まっている。実際、ブタおよびラットのBMECに対するUCBの影響（Akinら、2002年; Cardosoら、2012年）およびマウスBMEC系（Kapitulnikら、2012年）におけるUCBの誘導は内皮細胞の喪失を誘導することを明らかにした。実行可能性ヒトＢＭＥＣ（ＨＢＭＥＣ）に関する我々の最近の研究は、ＵＣＢが内皮細胞の生存を減少させ、病的状態におけるＢＢＢ破壊に関与することが知られているインターロイキン−６のようなサイトカインの放出を誘導することを示した（Ｐａｌｍｅｌａら、２０１１）。 （Kaur and Ling、2008; Carvey et al。、2009）。さらに、UCBへのHBMEC曝露は、相互作用の時間に応じて二相性の効果をもたらし、長期のインキュベーションは内皮接合部を損ない、バリアの完全性を著しく損なった（Palmela et al。、2012）。興味深いことに、アストロサイトの存在下でもBMECのバリア特性のUCB誘発破壊が観察された（Cardoso et al。、2012）、これはin vivo条件によりよく似たin vitro共培養モデルである。重要なことに、これらのインビトロ証拠は、脳実質における血管新生の増加および赤血球およびアルブミンの浸潤を示す、黄疸早産児の剖検研究において確認されている（Brito et al。、2013）。さらに、最近のKernicterus症例の研究では、小脳、海馬、大脳基底核などのUCB毒性に対する最も感受性の高い脳領域が、周皮細胞の血管被覆および基底膜の変化としてBBB機能障害の顕著な兆候を示している。パルメラら、提出）。したがって、これらの特徴は、少なくともビリルビン脳症を伴う重症の早産児において、血管壁の透過性が向上していることを示している。
ヒトの循環中に非常に低レベルで存在する胆汁酸ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）は、胆汁うっ滞を伴う慢性肝疾患の治療として広く使用されている（Ｐｏｕｐｏｎら、１９９４年； Ｂｒｉｔｅｓら、１９９８年； Ｌａｚａｒｉｄｉｓら、１９９４年）。 、２００１）。 ＵＤＣＡは、肝臓起源のタウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）およびグリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）にコンジュゲートされており、これは治療中の患者において産生される胆汁酸コンジュゲートの約８０％を占める（Rudolph et al。、2002）。さらに、TUDCAのそれと比較してGUDCAの4倍の増加が、UDCAで治療された完全な肝外胆道閉塞を有する患者の胆汁において見出された（Rudolph et al。、2002）。いくつかの研究は、この胆汁酸の抗アポトーシス特性のために、アポトーシスレベルの増加を伴う非肝臓疾患の治療におけるUDCAの潜在的な役割を示唆している（Amaral）。ら、２００９ｂ）。興味深いことに、UDCAの抗アポトーシス特性は最近ビリルビンにさらされた骨芽細胞で示されました（Ruiz-Gaspa et al。、2014）。我々自身の研究は、ＵＤＣＡおよびＧＵＤＣＡがアストロサイトをアポトーシスから保護しそして炎症誘発性サイトカインの産生を抑制することを示した（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、２０００年； Ｓｉｌｖａら、２００１ｂ； Ｆｅｒｎａｎｄｅｓら、２００７ａ）。神経細胞死とシナプスの変化（Silva et al。、2012）。さらに、GUDCAは、ニューロンの酸化還元状態、ミトコンドリア機能障害およびエネルギー障害におけるUCB誘発性の変化を無効にした（Britoら、2008年; Vazら、2010年）。興味深いことに、ＵＤＣＡおよびそのコンジュゲートの作用機序は、細胞膜構造の安定化およびその動的特性の維持に依存しているように見え、それらは、膜脂質の極性および流動性ならびにタンパク質秩序の変化を妨げる能力から導かれる。および酸化還元状態（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、２００１、２００２ｂ； Ｓｏｌａら、２００２）。
ヒトの循環中に非常に低レベルで存在する胆汁酸ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）は、胆汁うっ滞を伴う慢性肝疾患の治療として広く使用されている（Ｐｏｕｐｏｎら、１９９４年； Ｂｒｉｔｅｓら、１９９８年； Ｌａｚａｒｉｄｉｓら、１９９４年）。 、２００１）。 ＵＤＣＡは、肝臓起源のタウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）およびグリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）にコンジュゲートされており、これは治療中の患者において産生される胆汁酸コンジュゲートの約８０％を占める（Rudolph et al。、2002）。さらに、TUDCAのそれと比較してGUDCAの4倍の増加が、UDCAで治療された完全な肝外胆道閉塞を有する患者の胆汁において見出された（Rudolph et al。、2002）。いくつかの研究は、この胆汁酸の抗アポトーシス特性のために、アポトーシスレベルの増加を伴う非肝臓疾患の治療におけるUDCAの潜在的な役割を示唆している（Amaral）。ら、２００９ｂ）。興味深いことに、UDCAの抗アポトーシス特性は最近ビリルビンにさらされた骨芽細胞で示されました（Ruiz-Gaspa et al。、2014）。我々自身の研究は、ＵＤＣＡおよびＧＵＤＣＡがアストロサイトをアポトーシスから保護しそして炎症誘発性サイトカインの産生を抑制することを示した（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、２０００年； Ｓｉｌｖａら、２００１ｂ； Ｆｅｒｎａｎｄｅｓら、２００７ａ）。神経細胞死とシナプスの変化（Silva et al。、2012）。さらに、GUDCAは、ニューロンの酸化還元状態、ミトコンドリア機能障害およびエネルギー障害におけるUCB誘発性の変化を無効にした（Britoら、2008年; Vazら、2010年）。興味深いことに、ＵＤＣＡおよびそのコンジュゲートの作用機序は、細胞膜構造の安定化およびその動的特性の維持に依存しているように見え、それらは、膜脂質の極性および流動性ならびにタンパク質秩序の変化を妨げる能力から導かれる。および酸化還元状態（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、２００１、２００２ｂ； Ｓｏｌａら、２００２）。
内皮細胞に対するこれらの胆汁酸の有益な効果に関しては、ほとんど知られていない。それにもかかわらず、TUDCAはアミロイド-β誘導アポトーシス（Viana et al。、2009）および白血球ローリングおよび脂質過酸化生成物によって誘導された内皮への接着（Vladykovskaya et al。、2012）に対しても防御できることが示された。船舶修理の促進に関して（Cho et al。、2015）。興味深いことに、UDCAはエンドセリン-1産生を阻害し（Ma et al。、2004）、抗血管新生能を有することが示され（Suh et al。、1997; Woo et al。、2010）、内皮細胞への影響が示唆された。はるかに複雑な方法です。しかしながら、ＵＤＣＡおよびＧＵＤＣＡの保護効果がヒトＢＢＢの内皮細胞に、特にＵＣＢ誘発損傷に向けて発揮されるかどうかは依然として不明である。したがって、我々はここでそのような胆汁酸がUCB誘発アポトーシスおよび超微細構造変化からHBMECを保護することができるかどうかを最初に評価することを目的とした。次に、本発明者らは、ＵＤＣＡおよびＧＵＤＣＡが内皮透過性のメディエーター、インターロイキン−６、ならびにＵＣＢによって誘導されるバリアの完全性の変化の生成を防止することができるかどうかを調査することを意図した。 UCB曝露の前、または孵卵開始後4および8時間に細胞をUDCAおよびGUDCAで処理することにより、ビリルビン誘発性神経機能障害が必要とされる黄疸の乳児に使用する機会の治療ウィンドウを確立することを目的とした。従来の治療法を補完する薬。
材料および方法
化学薬品
基礎培地Roswell Park Memorial Institute 1640、抗生物質 – 抗真菌剤溶液、ヒト血清アルブミン（画分V、脂肪酸不含）、ウシ血清アルブミン、Hoechst 33258染料、フルオレセインナトリウムおよびUCBは、Sigma Chemical Co.（St. louis、）から購入した。米国ミズーリ州）。非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、ウシ胎児血清および最小必須培地ビタミンは、Biochrom AG（Berlin、Germany）から入手した。 Nuserum IVおよびラットテールコラーゲンIは、BD Biosciences（Erembodegem、ベルギー）から入手した。 TRIzol Plus RNA精製キットは、Invitrogen（Carlsbad、CA、USA）から入手した。カスパーゼ-3基質およびAc-Asp-Glu-Val-Asp-p-ニトロアニリドは、Calbiochem（San Diego、CA、USA）から入手した。 DuoSet ELISAキットは、R＆D Systems（Minneapolis、MN、USA）から入手した。リアルタイムPCR分析用のプライマーは、Thermo Scientific（Soeborg、Denmark）から購入した。 RevertAid Hマイナス一本鎖cDNA合成およびMaxima SYBR Green qPCR Master Mix（2×）は、Fermentas（Burlington、ON、Canada）から入手した。他の全ての化学物質は分析用グレードのものであり、Merck（Darmstadt、Germany）から購入した。
細胞培養および処理
内皮細胞に対するＵＣＢ誘発損傷がＵＤＣＡおよびＧＵＤＣＡの存在下で無効にされ得るかどうかを試験するために、我々はヒトＢＢＢの単純化モデルとしてＨＢＭＥＣ株を使用した。この細胞株は、ＳＶ４０ラージＴ抗原でトランスフェクトされたＨＢＭＥＣの初代培養物に由来し（Ｓｔｉｎｓら、２００１）、最近、バリア性に関してインビトロＢＢＢに最も適したヒト細胞株であることが証明された（Ｅｉｇｅｎｍａｎｎら、１９９５）。 2013）。細胞を、１０％ウシ胎児血清、１０％ＮｕＳｅｒｕｍ ＩＶ、１％非必須アミノ酸、１％最小必須培地ビタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ ｌ－グルタミン、および１ｍＭを補ったＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地で培養した。前述のように、コラーゲンＩ被覆カバーガラスまたはプレートに８×１０ ４細胞／ ｍＬの密度で播種し、培養２日後に処理した（Ｐａｌｍｅｌａら、２０１１）。完全性研究のために、フルオレセインナトリウムに対する傍細胞透過性の測定に基づいて、細胞をコラーゲンＩ被覆ポリエステルトランスウェルインサート（０．４μｍ、Corning Costar Corp.、USA）上に８×１０ ４セル／インサートの密度で播種し、その後処理した。培養8日間（Palmela et al。、2012）。内皮培養物を、５％ＣＯ ２に富む湿潤雰囲気中で３７℃に維持し、そして全ての実験をコンフルエントで実施した。
UCBを精製し（Mcdonagh and Assisi、1972）、10 mMストック溶液を0.1 M NaOH中で調製し、調製直後に使用した。等量の０．１Ｍ ＨＣｌを添加することによってｐＨ値を７．４に回復させ、そして光分解を回避するために全ての手順を遮光下で実施した。 ＨＢＭＥＣ系の集密的単層を１００μＭのヒト血清アルブミンの存在下で１００μＭのＵＣＢと共に、または添加せずに（対照）インキュベートした。この実験条件は、我々が報告した黄疸の症例で見られたビリルビン/アルブミン比（1：1のモル比; 8.7 mg / g）を模倣し、最近関連した5.4〜21.0 mg / gの比の範囲内である。エジプトでは急性ビリルビン脳症に罹患している（Iskander et al。、2014）。広く使用されているペルオキシダーゼ法による非結合ビリルビン、または遊離ビリルビンの決定（Rocaら、2006）は、Palmelaらによって以前に報告されたように、この実験条件が23.6nMの遊離ビリルビン濃度に対応することを示した。 （2012）。本インビトロモデルにおいて使用される遊離ビリルビンレベルは、中等度黄疸新生児群（１９．１±１．５ｎＭ）において我々によって見出された値の範囲内であり、そしてＡｈｌｆｏｒｓ ｅｔ ａｌ。 （2009）（21–51 nM）乳児で黄疸のために再入院した。また、我々の研究室で得られた遊離ビリルビン値とRocaらによって示されたものとの間の明らかな食い違いがあることを言及すること。 （2006）Roca等による事実に起因するかもしれません。 （2006）それらのシステムに細胞を含みませんでした、従って細胞に結合/含まれるビリルビンの割合（Britoら、2000年; Palmelaら、2012年）もUCB異化作用のための非共役経路も考慮しませんでした（Ahlfors et al。、2009）。各パラメーターに使用される潜伏期間は、以前の研究で観察された最大の効果を得るための時間に基づいて、1〜48時間の間で変動した（Palmela et al。、2011、2012）。インキュベーション培地は、インキュベーション培地中のアルブミンの最終濃度の乱れを避けるために、ウシ胎児血清およびNuserum IVを含まない通常の培地中にあった。
胆汁酸ＵＤＣＡおよびＧＵＤＣＡ、非抱合型については１０００、グリシンアミド化分子については１０５のオクタノール／水分配係数を有する分子、ならびに前者および後者については３．０および２．０２のｌｏｇＰ値を用いて同時インキュベーション研究も行った。 （Roda et al。、1990）。同時インキュベーション試験において、ＵＤＣＡまたはＧＵＤＣＡを５０μＭの最終濃度で添加した。これは、ＵＤＣＡによる治療を受けている患者の循環中に見出される。特に、５０μＭのＧＵＤＣＡの濃度は、１日当たり体重１キログラムあたり１３〜１５ｍｇの用量でＵＤＣＡで治療した後の患者の血清中に一般的に見られる（Ｐｏｄｄａら、１９９０； Ｐｏｕｐｏｎら、１９９４ ； Ｂｒｉｔｅｓら、１９９８）。我々は以前、そのような濃度がニューロンに対して毒性ではないことを示し（Silva et al。、2001b）、そして最も重要なことに、神経変性の予防において有益な特性を有する（Brito et al。、2008; Vaz et al。、2010）。胆汁酸を３つの異なる時点で添加した：ＵＣＢ添加の１時間前およびＵＣＢインキュベーションの４または８時間後。短期間のＵＣＢインキュベーションについては、胆汁酸との１時間のプレインキュベーションの効果のみを評価した。これらの分子の毒性がないことを確認するために、ＵＤＣＡおよびＧＵＤＣＡ（ＵＣＢなし）で処理した細胞を含む適切な対照も含めた。
完全性実験のために、内皮細胞を培養プレートウェルに挿入された半透性フィルター上で培養した。このシステムでは、2つのコンパートメントがあります：UCB、胆汁酸およびヒト血清アルブミンが添加された「血液側」と見なすことができる頂端または上部コンパートメント、および脳側」
アポトーシスの評価
カスパーゼ-3活性およびアポトーシス核の数は、これらの時点がUCB単独の最大効果を表すので、それぞれ4および48時間のUCB曝露後に決定された（Palmela et al。、2011）。
我々の研究室で通常行われているように（Palmela et al。、2011）、カスパーゼ-3の活性を比色法（Calbiochem、Darmstadt、Germany）により測定した。結果は、対照値からの倍数変化として表した。ヘキスト３３２５８染色後のＨＢＭＥＣ系統の核形態の評価は、以前に記載されたように評価した（Ｐａｌｍｅｌａら、２０１１）。 ＡｘｉｏＳｃｏｐｅ．Ａ１顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ、ゲッティンゲン）に適合させたＬｅｉｃａ ＤＦＣ ４９０カメラ（Ｌｅｉｃａ、ドイツ、ウェッツラー）を用いて蛍光を可視化した。値はアポトーシス核の百分率として表した。
透過電子顕微鏡法
ＵＤＣＡまたはＧＵＤＣＡで前処理したＨＢＭＥＣ中でＵＣＢに４８時間暴露した後、透過型電子顕微鏡法によって超微細構造分析を行った。細胞を、０．１Ｍリン酸緩衝液中の１．２％グルタルアルデヒドおよび同じ緩衝液中の１％四酸化オスミウムで固定し、段階的な一連のエタノールで脱水し、次いでエポキシ樹脂中に包埋した。超薄切片を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、80kVの加速電圧でHitachi H-7500透過型電子顕微鏡（東京、日本）で観察した。
インターロイキン6 mRNA発現とタンパク質放出の測定
インターロイキン-6の発現および分泌におけるUCB単独の最大の効果がこれらの時点で観察されたので、HBMEC系をmRNA分析のために1時間、およびサイトカイン放出定量のために4時間UCBに曝露した（Palmela et al。、2011）。 ）
ｍＲＮＡ発現の分析は、以前に記載されているように（Ｐａｌｍｅｌａら、２０１１）、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２×）を用いた定量的リアルタイムＰＣＲによって行った。このアッセイは、インターロイキン-6 mRNAの発現レベルを標準化するための内因性対照としてβ-アクチンを使用して実施した。以下の配列をプライマーとして使用した：インターロイキン−６センス、５’− ＧＡＣＡＧＣＣＡＣＴＣＡＣＣＴＣＴＴＣＡ − ３ ‘およびアンチセンス、５’− ＴＴＣＡＣＣＡＧＧＣＡＡＧＴＣＴＣＣＴＣ − ３’（Ｗａｎｇら、２００６）。 β-アクチンセンス、5’-ACAGAGCCTCGCCTTTGCCG-3 ‘およびアンチセンス、5’-TGGGCCTCGTCGCCCACATA-3’（NM_001101.3）。 PCRの非特異的産物はいずれの場合にも見出されなかった。個々の遺伝子の効率を考慮に入れて、ΔΔＣＴ式のＰｆａｆｆｌ修正（ＣＴ、蛍光が検出の閾値レベルを超えるサイクル数）を使用して相対定量化を行った。結果をβ－アクチンに対して正規化し、各サンプルの鋳型の初期量を対照サンプルからの倍率変化として決定した（参照）。
内皮インターロイキン-6放出は、製造元の説明書に従って、特定のDuoSet ELISA開発キットを用いて二重に評価した。マイクロプレートリーダーを使用して、６２０ｎｍの参照フィルターを用いて４５０ｎｍの波長で測定値を得た。平均対照値は１３５ｐｇ ／ ｍＬであり、結果は対照からの変化倍数として表した。
透過率測定によるバリアの健全性の評価
透過性を調節するＵＤＣＡおよびＧＵＤＣＡの能力は、４８時間ＵＣＢで処理した細胞において評価され、その時点は、ＵＣＢによるＨＢＭＥＣ単層の完全性状態の最大の崩壊をもたらす（Ｐａｌｍｅｌａら、２０１２）。
我々の以前の研究では、UCBがフルオレセインナトリウム（Palmela et al。、2012）、低分子量トレーサー（376 Da）に対する透過性を増加させるが、アルブミン結合Evans blue（高分子量トレーサー）に対しては増加させないことを見出した（68）。 kDa）したがって、この研究では、HBMEC傍細胞透過性アッセイを、以前に記載されているように（Veszelkaら、2007年； Cardosoら、2012年； Palmelaら、2012年）、フルオレセインナトリウムを用いて行った。簡単に説明すると、細胞培養インサートを、基底部にRinger – Hepes溶液（118 mM NaCl、4.8 mM KCl、2.5 mM CaCl 2、1.2 mM MgSO 4、5.5 mM d-グルコース、20 mM Hepes、pH 7.4）を含む12ウェルプレートに移した。コンパートメント。フルオレセインナトリウム溶液（リンゲル – ヘペス中の10 mg / mLフルオレセインナトリウム）を上部チャンバーに加えた。 20、40、および60分後にインサートを新しいウェルに移した。下部チャンバー溶液を収集してナトリウムフルオレセインレベルを決定した（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｆ － ２０００蛍光分光光度計、励起：４４０ｎｍおよび発光：５２５ｎｍ）。無細胞インサートを横切る流束もまた測定した。内皮透過係数は、以前に記載されたように計算され（Ｄｅｌｉら、２００５）、平均対照透過係数は１．４×１０ －５ ｃｍ ／ ｓであった。
HBMEC単層を横切るUDCAおよびGUDCAの通過の評価
ＵＤＣＡおよびＧＵＤＣＡがＢＢＢ内皮を通過することができるかどうかを立証するために、二室培養システムを使用した。胆汁酸を上部チャンバーに添加し、そして下部チャンバーからの培地を４および４８時間のインキュベーション後に集めた。 ＨＢＭＥＣ単層を横切る胆汁酸通過は、酵素 – 蛍光定量アッセイによってＵＤＣＡおよびＧＵＤＣＡの濃度を測定することによって評価された（Ｂｒｉｔｅｓら、１９９８）。結果は平均濃度（μＭ）±ＳＥＭとして示した。
統計分析
結果は、少なくとも３回の別々の実験からの平均値±ＳＥＭ値として表される。群間の差は、Ｐｒｉｓｍ ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を用いた一元配置分散分析によって決定した。 P値が0.05未満の場合、統計的有意性が考慮されました。
結果
UDCAとGUDCAはUCB誘導アポトーシスからHBMECを保護するが、カスパーゼ3活性化の減少にはGUDCAだけが有効である
ＨＢＭＥＣ系におけるＵＣＢ誘導アポトーシスは、曝露時間と共に増加しそして４８時間で最大レベルに達したアポトーシスの特徴の存在を含む（Ｐａｌｍｅｌａら、２０１１）。したがって、今回は、UDCAおよびGUDCAがHBMECをUCB誘導アポトーシスから保護する能力を評価するために選択された。胆汁酸を３つの異なる時点で添加し、損傷の前後に添加した場合のそれらの可能性を評価した。 UDCAとGUDCAの添加により、添加時期にかかわらずUCB損傷が減少しました（図（図1）.1）。この保護効果は、特にＵＣＢ添加の１時間前に添加した場合に、ＧＵＤＣＡによる処置において最大であった（ＵＣＢ値からの５４％の減少、Ｐ ＜０．００１、同じ時点でのＵＤＣＡについての４２％、Ｐ ＜０．０１）。重要なことに、UCB添加の8時間後に添加した場合、胆汁酸は部分的にUCB損傷と比較して約30％の防御率減少でUCB損傷を回復させた（図（図1）、1）。
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